骨髓间充质干细胞对衰老模型大鼠肺损伤的修复作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现外源性骨髓间充质干细胞能够定居于肺脏组织，参与肺组织的再生，但其修复衰老肺损伤方面的报道较少。
目的：观察骨髓间充质干细胞减轻D-半乳糖所致肺脏组织损伤的作用。
方法：选择SD大鼠30只，随机分为3组，包括对照组、衰老模型组、细胞治疗组，每组10只。衰老模型组和细胞治疗组大鼠每日皮下注射D-半乳糖，连续4个月制备衰老模型。细胞治疗组通过尾静脉输注3×106 个骨髓间充质干细胞，每周1次，连续4周；对照组和衰老模型组给予同等剂量的细胞培养液。采用表达绿色荧光蛋白的慢病毒载体标记骨髓间充质干细胞，以确定骨髓间充质干细胞在大鼠肺脏的植入情况。测定3组大鼠肺脏组织中超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平；苏木精-伊红染色观察3组大鼠肺脏组织结构的差异。
结果与结论：绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞移植给大鼠后，能向肺脏组织迁移并存活。与衰老模型组相比，细胞治疗组肺脏的超氧化物歧化酶活性明显升高，丙二醛水平明显降低。各组大鼠的组织病理切片显示，模型组大鼠的正常肺泡结构破坏，出现气腔扩大、肺气肿改变；而细胞治疗组大鼠的肺脏损伤有明显修复。结果可见骨髓间充质干细胞对衰老大鼠的肺脏损伤有修复作用，从而发挥其抗衰老作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 衰老模型, 骨髓间充质干细胞, 肺脏损伤, 抗衰老, 绿色荧光蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that exogenous bone marrow mesenchymal stem cells can settle down in lung tissue, participate in long regeneration, but few studies concerned the repair of aging lung injury.
OBJECTIVE: To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on lung injury induced by D-galactose.
METHODS: A total of 30 Sprague-Dawley rats were equally divided into three groups at random: control group, aging model group and cell treatment group. To establish the aging rats, 10 rats each in the aging model group and cell treatment group were daily subcutaneously injected with D-galactose for 4 months. 3×106 bone marrow mesenchymal stem cells were transplanted via caudal vein in the cell treatment group, once a week, for 4 weeks. Cell medium of equal dose was added in the control and aging model groups. Bone marrow mesenchymal stem cells were transfected by lentiviral vectors expressing green fluorescent protein to determine the implantation of bone marrow mesenchymal stem cells in rat lung. Superoxide dismutase activity and malondialdehyde content in rat lung were measured in each group. The difference in rat lung structure was observed using hematoxylin-eosin staining in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells marked by green fluorescent protein were implanted in rats, migrated towards lung tissue and survived. Compared with aging model group, superoxide dismutase activity was apparently increased, but malondialdehyde content was obviously diminished in the cell treatment group. In each group, histopathological sections revealed that normal pulmonary alveolus was damaged in the aging model group, showing enlarged air cavity and emphysema. Lung injury was evidently repaired inthe cell treatment group. Results suggested that bone marrow mesenchymal stem cells could repair lung injury in aging rats, and exert anti-aging effects.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, aging, lung injury, rats, Sprague-Dawley

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞培养及流式细胞仪鉴定结果采用贴壁法培养的骨髓间充质干细胞传代培养至第3代，光镜下见细胞呈星形、梭形(图1A)；经苏木精-伊红染色，细胞核圆、色淡蓝、位于细胞中央，胞质肥大，胞膜清晰(图1B)；将骨髓间充质干细胞以10个/cm²的细胞密度接种于培养板上，1周后可形成散在分布的克隆(图1C)；使用流式细胞仪对第3代骨髓间充质干细胞进行细胞周期检测，结果显示骨髓间充质干细胞中G₁期的细胞约占80%以上(图2)。流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞的表面标记物。结果发现，CD29阳性细胞99.9%，CD44阳性细胞数97.8%，CD34和CD45阴性细胞数分别为99.3%，99.1%，结果表明符合骨髓间充质干细胞表面分子标记特征(图3)。

2.2 衰老模型的评价对照组大鼠精神状态较好，毛发光泽，行动灵敏。衰老模型组大鼠连续给D-半乳糖4个月后，出现毛色枯黄，行动缓慢，体质量减轻，呈现明显的衰老体征。与对照组比较，模型组血清中超氧化物歧化酶活性明显降低(P < 0.05)，丙二醛水平明显升高(P < 0.05)。细胞治疗组大鼠较模型组大鼠有明显好转。

2.3 绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞以及骨髓间充质干细胞在大鼠肺脏的定位腺病毒(EGFP-CMV)转染后24 h，倒置荧光显微镜下可见表达绿色荧光的细胞；48-72 h 多数细胞表达绿色荧光，荧光增强(图4A)。分别于骨髓间充质干细胞回输3，7 d后，取出大鼠的肺脏组织，制备冰冻切片，在荧光显微镜下观察到荧光细胞存在(图4B，C)。

2.4 超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平测定模型组大鼠与对照组相比较，其肺脏中超氧化物歧化酶的活性显著降低(P < 0.01)；而肺脏中丙二醛水平明显升高(P < 0.01)。与模型组相比，细胞治疗组大鼠肺脏中超氧化物歧化酶的活性明显升高(P < 0.01)；而肺脏中丙二醛水平明显降低 (P < 0.01，表1)。

2.5 组织病理学的检测对照组大鼠肺组织的肺泡大小比较均匀，且肺泡间隔较厚。衰老模型组的肺脏表现为肺气肿改变，肺泡大小不一，正常肺泡结构破坏，气腔扩大，肺泡间隔变窄。与模型组相比，细胞治疗组大鼠的上述变化有所改善，肺泡大小比较均匀，肺泡间隔增厚(图5)。

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引言

衰老是自然规律，是人类无法避免的必经阶段。现代医学对衰老机制的研究有很多种学术流派，但关于衰老的机制目前还未根本确定，除了饥饿疗法得到公认外，抗衰老研究也没有大的进展。抗衰老药物是一类以提高生命效率为最终目的，从多系统、多层次和多阶段来发挥其调整功能^[1]，并能在遗传学上所界定的寿限内延迟衰老或提高生命质量的药物。从古至今进行了大量探索，已积累了一些经验和有效的方法^[2-3]，也开发出了一些抗衰老药物^[4]。虽然目前有很多药物都被证明能够延缓衰老，但抗衰老药物不可乱用，其导致的毒副反应病例日见增多^[5-6]。间充质干细胞存在于机体的多种组织中，关于间充质干细胞的研究来源多取材于骨髓组织。间充质干细胞具有广泛的分化潜能^[7-10]，在体内外实验中发现，间充质干细胞能够分化成一些重要的中胚层组织，例如骨骼、脂肪、肌肉、心肌组织等^[11-13]。随着对间充质干细胞的深入研究，目前认为间充质干细胞除了具有多向分化潜能，还能在损伤局部反应性分泌各种各样的营养因子，这些因子包括神经生长因子、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、碱性成纤维生长因子等^[14-17]，这些因子也参与了组织器官的损伤修复。因此间充质干细胞被称为组织重建的种子细胞，许多组织或器官的缺损或病变可以通过间充质干细胞移植进行治疗。

根据间充质干细胞的生物学特性，间充质干细胞被越来越多地用于临床治疗中，如烧伤整形、心血管、神经科和骨科等领域的应用研究都取得很好的成果^[18-20]，而间充质干细胞作为靶细胞用来治疗衰老相关的肺脏损伤方面的报道还较少。有研究发现，将胎鼠源间充质干细胞移植给衰老小鼠后，小鼠的肺气肿改变有明显恢复，结果提示移植小鼠胎鼠源干细胞能有效地延缓小鼠衰老进程^[21]。另有研究报道，经骨髓间充质干细胞治疗的肺气肿模型大鼠的肺泡数明显增加，DAPI标记的间充质干细胞进入了受损的肺组织，还发现其分化为上皮细胞。说明骨髓间充质干细胞治疗大鼠实验性肺气肿是有效的^[22]。

干细胞的研究为提高组织损伤修复、治疗衰老退行性疾病、甚至延缓组织器官的年龄依从性功能下降带来希望^[23]。因此，本实验研究了骨髓间充质干细胞减轻 D-半乳糖所致肺脏组织损伤的作用，初步探讨了间充质干细胞对D-半乳糖致衰老大鼠肺脏的修复作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年5月至2011年5月在南方医科大学珠江医院血液科实验室与动物中心实施。

材料：

实验动物：选用8-10周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量160-180 g，均购自南方医科大学动物实验中心(动物编号：SCXK粤2006-0015)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养与鉴定：

骨髓间充质干细胞的培养：将SD大鼠麻醉处死，在无菌条件下取大鼠双侧股骨和胫骨，去除骨膜及残留肌肉，浸泡于DMEM培养液中，使用DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，将细胞悬液收集于离心管。200目钢网过滤，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清。离心后，加入DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清)，重悬细胞，计数，以2×10⁶个细胞接种于25 cm²培养瓶，置37℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的培养箱内培养。待贴壁细胞生长达80%-90%融合时传代。细胞传代培养至第3代，倒置显微镜下观察细胞形态；选取生长状态良好的第3代细胞，计数后接种于6孔板内 (10个/cm²的细胞密度)。2周后观察骨髓间充质干细胞的克隆形成能力，同时进行结晶紫染色。

细胞周期检测：分别取生长状态良好的第3代细胞，制成1×10⁵的细胞悬液，4 ℃预冷乙醇隔夜固定，PBS漂洗离心。37 ℃的RNAsin处理30 min，离心，加入碘化丙碇，染色30 min，流式细胞仪检测。

细胞表面抗原表达：取生长良好的第3代细胞，胰酶消化后，用PBS调整细胞量为2×10⁵，制成4个样本，分别加入荧光标记单克隆抗体(包括CD29，CD34，D44和CD45)，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，同时用磷酸盐缓冲液作为一抗设置阴性对照。

D-半乳糖致衰老动物模型的建立及回输骨髓间充质干细胞：30只SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。模型组和治疗组大鼠每天用D-半乳糖通过颈背部皮下注射，剂量为400 mg/kg，连续注射4个月，制备衰老大鼠模型，自由进食进水，对照组给予同等剂量的生理盐水。制作衰老模型后，细胞治疗组大鼠通过尾静脉输注3×10⁶个同种异体骨髓间充质干细胞，每周1次，连续4周。同时，对照组和模型组通过尾静脉输送同等剂量的DMEM细胞培养液。

绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞，观察骨髓间充质干细胞在大鼠肺脏内的分布：细胞生长到约80%汇合的第3代骨髓间充质干细胞，每瓶(25 cm²/瓶)加入腺病毒(EGFP-CMV)上清液2 mL。孵育3 h后，补充DMEM细胞培养液，再继续培养48 h，然后在荧光显微镜下观察感染腺病毒情况。将绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞吹打成单细胞，并计数。取3×10⁶个骨髓间充质干细胞悬液，通过尾静脉输注给衰老模型大鼠。3 d后，将大鼠处死，取出肺脏组织制作冰冻切片，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白标记情况，流式细胞仪测标记率。

生化指标测定：给予细胞治疗4周后，分别取3组大鼠肺脏组织，按试剂盒说明书，测定其超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平。超氧化物歧化酶活性测定采用黄嘌呤氧化法，丙二醛水平测定用硫代巴比妥酸比色法。

肺脏组织的形态学观察：给予连续4周细胞治疗后，取各组大鼠的肺脏组织，体积分数为10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，最后在光学显微镜下进行形态学观察，比较3组大鼠肺脏组织结构的差异情况。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析，所有数据均以x(_)±s表示，以方差分析进行统计处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

衰老是多环节的生物学过程，随着年龄的增长，体内各器官系统可出现一系列形态学的退行性变化，最终导致机体功能逐渐减弱。而自由基学说认为在正常生物代谢过程中细胞会不断产生自由基，它们可以被细胞内的防御系统清除，不会造成危害^[24]。许多报道表明，丙二醛的生成量反映体内细胞受自由基氧化的程度，在衰老过程中起重要作用^[25]，阻止丙二醛在体内的大量蓄积和提高超氧化物歧化酶的活性，可延缓衰老过程。有研究发现随着年龄的增长，成体干细胞功能逐渐降低、数目减少，机体干细胞和其他细胞的再生能力逐渐下降，机体因而也逐渐衰老^[26]。因此补充外源间充质干细胞有可能改善老年动物生存质量，提高动物寿命。近来有实验通过补充外源幼稚的同基因小鼠胎鼠源间充质干细胞，发现胎鼠间充质干细胞移植有确切的抗衰老功效，并认为可能通过分化替代途径延缓小鼠脏器功能衰退^[21]。 D-半乳糖在体内氧化产生的大量自由基超过机体的清除能力，引发脂质过氧化的链式反应，产生大量的脂质过氧化物丙二醛，加重对细胞的损伤，并伴随着抗氧化酶超氧化物歧化酶的减少^[27]。目前有关间充质干细胞抗衰老的研究，多采用D-半乳糖致衰老模型。与自然衰老模型、臭氧损伤模型相比，D-半乳糖衰老模型简便易行，结果稳定，已被广泛应用于药物抗衰老的研究之中^[28-29]。所以实验采取D-半乳糖连续皮下注射4个月，从模型组大鼠的一般情况以及血清中超氧化物歧化酶水平、超氧化物歧化酶的活性变化，均能证明本实验衰老模型制作成功。

实验结果显示，衰老模型组大鼠肺脏损伤严重，而细胞治疗组大鼠的肺脏损伤有明显修复。D-半乳糖所致衰老大鼠模型中，反映抗氧化能力的超氧化物歧化酶活力降低，丙二醛水平增加。而骨髓间充质干细胞能有效降低丙二醛水平，增加超氧化物歧化酶活性，提高机体抗氧化损伤能力，减轻机体损伤的程度，从而可能对衰老大鼠产生一定保护作用。

本实验采用绿色荧光蛋白对移植的骨髓间充质干细胞进行标记，将标记的骨髓间充质干细胞输注给衰老大鼠后，取出肺脏组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察有荧光细胞存在。说明移植的细胞在大鼠体内能存活，而且能迁移到肺脏组织。这一结果说明骨髓间充质干细胞可能通过归巢到肺脏组织再发挥修复作用。正常情况下间充质干细胞在体内的主要作用是产生新的组织间质结构，替代老化的间质结构，从而促进各种组织细胞生长，而且它也能通过分化形成各种新的组织细胞，从而延缓器官功能的衰退。

另外近年来更多的报道倾向于认为植入的骨髓间充质干细胞与局部组织相互作用释放生长因子和细胞因子，从而发挥修复作用^[30-31]。目前认为骨髓间充质干细胞能在损伤局部反应性分泌血管内皮生长因子^[32]。有研究表明，血管内皮生长因子可以修复弹性蛋白酶所致大鼠肺气肿病变^[33]。Tang等^[34]利用基因敲除技术对鼠的肺部血管内皮生长因子进行灭活后，可造成动物肺中血管内皮生长因子水平一过性减低，随之出现肺泡间隔细胞和上皮细胞凋亡，气腔扩大等改变。因此，骨髓间充质干细胞可能通过分泌血管内皮生长因子，从而促进肺毛细血管再生，修复肺脏损伤。

本实验结果表明，间充质干细胞移植可以使大鼠的抗氧化能力得到明显提高，延缓了肺脏组织学、结构和功能衰老进程，提示大鼠骨髓来源间充质干细胞移植有抗衰老作用，能够修复衰老的肺脏组织。而关于骨髓间充质干细胞修复损伤的机制，临床应用及远期疗效，有待进一步的研究。